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蘋果酸發酵工藝有兩種： 即一步發酵法與兩步發酵法。

一步發酵法

菌種有黃曲霉、米曲霉、寄生曲霉等，均以包括葡萄糖在內的多種糖為底物產生L-蘋果酸。

兩步發酵法

由華根霉或少根根霉將葡萄糖生物合成富馬酸，再由膜醭畢赤酵母、普通變形菌、芽孢桿菌或擲孢酵母等將富馬酸轉化為L-蘋果酸。 一步發酵法較多地采用黃曲霉，它能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖及淀粉等多種糖質原料產生L-蘋果酸。但培養基較復雜，發酵過程常有富馬酸等其他有機酸產生，給分離提純帶來困難，難于得到高純度的晶體，再加上產酸低，對糖轉化率低 (30%～40%)，周期長(最少也需5天)，故至今在國內外均未實現工業化生產。

兩步發酵法的第一步，先用根霉將糖類發酵生成富馬酸，即富馬酸發酵，這里的糖較多的使用葡萄糖，葡萄糖可由淀粉經雙酶水解而得。

第二步是在前面所產的富馬酸中接入酵母菌或細菌進行發酵，將富馬酸轉化為L-蘋果酸，即轉化發酵。采用這種方法，蘋果酸對糖轉化率最高可達60%以上，但是畢竟發酵周期太長，前后加起來要8～9天。雖然兩步法與一步法一樣，國內外學者正在不斷地探索，取得了一些有價值的進展，但至今仍然未見工業化生產的報道。 無論是一步法還是兩步法發酵，如以淀粉為原料，在使用前都需進行水解處理，使之成為葡萄糖，而淀粉的水解方法是雙酶水解法。