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L-谷氨酰胺廣泛存在于自然界，例如，以游離狀態含于南瓜、向日葵的幼苗中，其N-乙基化合物（茶氨酸，theanine）含于茶葉中。雖然可自天然產物提取谷氨酰胺，但大量生產則采用發酵法和合成法。

合成法

由L-谷氨酸-5-甲酯（[1499-55-4]）經縮合、加成、成鹽、水解而得。谷氨酸在濃硫酸存在下與甲醇酯化，所得的酯化液滴加入甲醇和二硫化碳的混合液中，一邊滴加，一邊在冷卻下通氨。酯化液滴加完后，繼續通氨，然后加入三乙胺，在30℃密閉放置40h。經減壓濃縮趕氨后，得γ-甲酯-L-谷氨酸-N-氨荒酸二銨鹽濃縮液。將其加熱至40-45℃，加入乙酸。攪拌30分鐘后，減壓除去二硫化碳，此時析了大量結晶。然后加入等體積甲醇，于0℃放置12h，過濾，得谷氨酰胺粗品。經活性炭脫色、重結晶得成品。

發酵法

將葡萄糖或乙酸、乙醇作為培養基碳源，用黃色短桿菌（Brevibacterium flavum）菌種發酵，以葡萄糖計產率為39g/L，收率為39%。