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 1916年湯姆和柯里以曲霉屬菌進行試驗，證實大多數曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、溫氏曲霉、綠色木霉和黑曲霉都具有產檸檬酸的能力，而黑曲霉的產酸能力更強。如柯里以黑曲霉為供試菌株，在15％蔗糖培養液中發酵，對糖的吸收率達55％。1923年美國菲澤公司建造了世界上家以黑曲霉淺盤發酵法生產檸檬酸的工廠。隨后比利時、英國、德國、蘇聯等相繼研究成功發酵法生產檸檬酸。這樣，依靠從柑橘中提取天然檸檬酸的方法逐漸為發酵法所取代。1950年前，檸檬酸采用淺盤發酵法生產。19Chemicalbook52年美國邁爾斯試驗室采用深層發酵法大規模生產檸檬酸。此后，深層發酵法逐漸建立起來。深層發酵周期短，產率高，節省勞動力，占地面積小，便于實現儀表控制和連續化，這一制造技術仍是目前最主要的制造方法。在這個技術中，黑曲霉被放入含有蔗糖或葡萄糖的培養基中進行培養，以生產檸檬酸。糖類的來源包括玉米漿、糖蜜發酵液、玉米粉的水解產物或其他廉價的糖類溶液。在去除霉菌之后，向剩余的溶液中加入氫氧化鈣，使檸檬酸反應生成檸檬酸鈣沉淀，分離出沉淀之后再加入硫酸就可以得到檸檬酸。